乳酸中嗜热链球菌的分离及鉴定

1、2011届本科生毕业论文题目：乳酸中嗜热链球菌的分离及鉴定title : lactic acid streptococcus thermophilus cultured in the separation and identification系 另i：化学与生命科学学院 专 业：07级生物技术 学生姓名：邵志国学 号：2007090223指导老师：郭志华职 称：讲师2011年4月17号口的从乳酸小将嗜热链球菌分离出并进行鉴定。方法利用mrs培养基 将乳酸中的菌种培养，经过革兰氏染色、镜检分离出嗜热链球菌，最后选出7 株，对它进行菌落形态的观察。最后对其进行各种理化鉴定。结果镜检结果该 菌为革兰

2、氏阳性，经过生化鉴定该菌为嗜热链球菌。关键词：乳酸；嗜热链球菌；分离；鉴定。abstractobjective the streptococcus thermophilus cultured from lactic acid will isolate and evaluations, method use the media will lactic acid bacteria mrs cultivation, and after gram's staining, isolated anti-bma streptococcus thermophilus cultured, finally

3、 chosen for it, seven strains colony morphology observation. finally the various physical and chemical identification, result microscopy results this for gram-positive bacteria, after biochemical identified the bacteria for streptococcus thermophilus cultured.keywords: lactic acid; streptococcus the

4、rmophilus cultured; depart; appraisal目 录绪论51试验材料与方法61.1试验材料61.2实验试剂61.3 实验方法61.3.1 乳酸菌的筛选61.3.2 乳酸菌的分离纯化61.4理化性质的测定72结果与讨论82.1菌落形态和细胞形态82.2生化试验结果113 小结12参考文献13致谢14绪论乳酸菌是一类能利用可发酵的糖产生大量乳酸的细菌通称。这类细菌广泛分 布在土壤、植物根茎、湖泊及动物的体内。酸菌从形态上可以分为球菌和杆菌， 并且均为革兰氏染色阳性、在缺少氧气的环境屮生长良好的兼性厌氧性或厌氧性 细菌。目前，对乳酸菌的应用研究，着重于发酵乳制品、发酵食品

5、和医药工业等人 类生活密切相关的领域。乳酸是以新鲜牛乳经有效杀菌，用不同乳酸菌发酵剂制 成的乳制品。曲于该产品营养价值较高，并能改善肠道正常微生物区系的稳定， 因此它已成为深受消费者青睐的营养保健食詁。在我国市场上，生产销售的各种乳酸制品中，作为发酵剂使用的乳酸菌，通 常为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。乳酸的生产是利用原始菌种进行逐级扩大培 养方式进行，即活化复壮再进行扩大培养至乳酸菌的活力都达到可用程度 后，投入生产进行发酵。在发酵剂的活化过程中，工序多，技术要求严格，稍冇 不甚就会污染杂菌，通过对乳酸发酵剂嗜热链球菌的分离和鉴定能及吋掌握研究 进程和生产控制。1实验材料和方法1.1材料和仪器

6、乳酸：采购于超市伊利；化学试剂：均为国产分析纯。超净工作台、酒精 灯、接种环、灭菌锅等。1.2实验试剂mrs固体培养基：蛋白10 g,肉膏10 g,酵母捉取物5 g,柠檬酸二镀2 g,乙酸钠 5 g , khpo42 g, mnso4.4h2o 0.25 g, mgso4.7h2o 0.58g,葡萄 糖 20g,吐温 80 1ml,琼脂 25g,水 1000ml。调 ph6.2-6.4, 121°c灭菌 15min。py基础培养基:蛋白脓0.5 g,酵母提取物1.0 g,盐溶液4.0 g,蒸锚水100ml。 调ph值6.0左右，113°c灭菌20mino蛋白腺水培养基：蛋白

7、陈5g, nacl2.5g,蒸傭水500ml。调ph值7.0左右, 121°c 灭菌 20mino葡萄糖蛋白月东水培养基：蛋白月东5g,葡萄糖5g, khpo4 2g,蒸绸水1000ml, 调ph值7.07.2,过滤，121 °c灭菌30mino明胶基础培养基：蛋口豚l.og,酵母提取物l.og,葡萄糖01g,明胶12.0g, 盐溶液 4.0ml,蒸纟留水 100ml, ph 值 7.0,113°c115°c灭菌 1520min。可溶性淀粉培养基：向py培养基中加入0. 5%可溶性淀粉。1.3实验方法1.3. 1乳酸菌的筛选将乳酸均匀涂布于mrs培养基平

8、板上，37°c静置培养48ho1.3.2乳酸菌的分离纯化挑取培养基上的菌落，划线分离纯化2 3次，最后选择单菌落，经过镜检确 认为纯种，得到7株菌株，4°c斜面保存。将菌落平板和细胞形态在显微镜卜用 照相机照出。1.4理化性质的测定1.4. 1 koh 试验用灭菌的接种环加12环5%的koh溶液于干净的载玻片上，调菌于溶液中， 用环将其混合搅匀，短吋间内koh试剂阳性菌会越搅越稠，抬起接种环会产生拉 丝现象，而koh阴性菌则无拉丝现彖。1.4.2过氧化氢酶测定用灭菌的接种环加1、2环10%过氧化氢溶液于于净的载玻片上，挑菌于溶液 屮，搅拌均匀。观察产气泡情况，有气泡产生，则

9、判断为过氧化氢酶阳性反应。1. 4. 3需氧试验将分离纯化后的齐菌株分别接种于高层mrs液体培养基中，37°c静置培养 2d后，观察生长情况。1.4.4淀粉水解试验将各菌株分别接种到可溶性淀粉培养基屮，37°c培养1、2天。然后向培养液 中加入3 4滴卢戈氏碘液，如不显色表示淀粉水解阳性反应，显蓝黑色或蓝紫色 时，表示淀粉水解或水解不完全，为阴性反应。1.4.5明胶液化试验菌株接种后适温培养，观察结果时需经低温处理。如对照管（未接种） 凝固而接种管液化则为阳性反应，同时凝固或者液化为阴性反应。1.4.6眄|口朵试验向培养2d后的含菌蛋口豚水培养基内加3 4滴乙瞇，摇动数次，

10、静置imin 3min，待乙醸上升后,沿管壁徐徐加入2滴卩引味试剂，在乙醸和培养物之 间产生红色环状物为阳性反应，否则为阴性反应。1.4.7 v-p 试验将各菌株接种于葡萄糖蛋白陈水培养基屮，置37°c培养2d后，向培养物内 加入510滴40%的koii,然后加入等量的5% a -蔡酚溶液，用力振荡，再放入 37°c温箱中保温15min30min,以加快反应速度。若培养物成红色，则为v-p反 应阳性。1.4.8产葡聚糖测试将菌株接种丁加有10%蔗糖的mrs斜面培养基上，适温培养24d,如斜面培 养物形成粘稠状菌苔，表明产生葡聚糖，为阳性反应，否则为阴性反应。1.4.9碳水化

11、合物产酸试验采用py基础培养基，在其屮加入碳水化合物，终浓度达到1%,管内培养基 高度约4 5cmo灭菌后接入菌株各1环，37°c培养2d。取未加入碳水化合物的培 养基作为对照，结晶紫试剂比较颜色的变化记录产酸的强弱。2结果与讨论2. 1菌落形态和细胞分离到的7株菌，菌落乳白色、灰色或略显黄色；大而平坦或小而厚，菌落 湿润h大及边缘整齐。镜检细胞形态、大小、排列方式及革兰氏鉴定结果见表一表一 7株菌的形态特征及大小table 1 7 strains bacteria the morphological characteristics and size编号染色大小/um形态排列方式1g

12、+1. 0(1. 0-1. 5)椭球单个或呈短链2g+1. 0*(1. 0-1. 3)椭球单个或成对或呈短链3g+1. 0(1. 0-1. 4)椭球单个或呈短链4g+1. 0*(1. 0-1. 3)椭球单个或呈短链5g+1. 0(1. 0-1. 4)椭球单个或呈短链6g+1. 0*(1. 0-1. 5)椭球单个或呈短链7g+1. 0(1. 0-1. 5)椭球单个或成对或呈短链从表一看岀，从酸奶屮分离岀的7株为嗜热链球菌符合乳酸菌的特性。下面附平板和细胞的照片嗜热链球菌的细胞形态streptococcus thermophilus cultured cell type嗜热链球菌的菌落形态stre

13、ptococcus thermophilus cultured colony morphology2. 2生化试验检测结果对筛选的7株菌进行进一步的试验鉴定结果见表2、表3。从表2、表3可 见，所冇7株菌种都能水解淀粉，koh试验、接触酶试验、明胶液化试验、卩引味 试验均为阴性，但对丁多种糖的利用情况不同。表2 7株菌株的牛化试验结果table 27 strains isolated biochemical test result项目1234567koh试验淀粉水解+接触酶试验需氧试验好氧好氧兼性厌氧微好氧微好氧微好氧微好氧明胶试验眄際试验v-p试验+产葡聚糖+注表示阳性反应:表示阴性反应。表

14、3 7株菌的碳水化合物发酵产酸试验结果table 3results7 strainsbacteria carbohydratesfermentproduce acid test碳水化合物123467葡萄糖+麦芽糖+乳糖+蔗糖+注：“ + ”表示阳性反应：“-”表示阴性反应小结市售的乳酸屮的乳酸菌多为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌其屮球菌较少。采 用常规的革兰氏染色、形态观察的方法对分离到的菌株进行简单鉴定，该方法操 作简单、快速、实验结杲可靠。分离到的嗜热乳酸链球菌菌株经活化后可以应用 到生产屮。参考文献1 陈晓平，刘华英，魏晓川.自然发酵酸菜汁屮乳酸菌的分离筛选与鉴定研究j. 食品科学.2006(2) :91-93.2 杨晓晖，籍保平，李博，等泡菜中优良乳酸菌的分离鉴定及其发酵性能的研究 j 食品科学.2005 (5): 130-133.3 黄秀梨.微牛物学实验指导m.北京：高等教育岀版社，1999:58-594 邓放明，李罗明，尹华碎鲜辣椒发酵制品发酵用乳酸菌的选育与接种发酵试 验j.食品科学.2005 (3) : 106-10&黄君红，成洁珊，陈青荷.乳酸菌生长最佳培养基的筛选j,中国酿 造.2001(2)致谢在本论文完成z