乳酸菌对变异链球菌菌膜形成和黏附性的抑制作用（一）

龋齿是一种常见的口腔疾病，对口腔健康危害很大。其原因是变异链球菌（Streptococcus mutans）与口腔中的碳水化合物共同作用，形成的有机酸（主要是乳酸）不断地侵蚀包裹在牙齿外面的牙釉质，进而使牙齿硬组织发生去矿化作用而形成龋齿。变异链球菌的致病作用依赖于其对光滑牙面的黏附能力，一般来说，这种黏附作用主要通过两个阶段实现：首先是变异链球菌通过氢键和疏水作用等蔗糖非依赖性黏附实现初始黏附；然后是经蔗糖依赖性黏附，主要是水不溶性胞外多糖，使变异链球菌黏附到牙面上，该过程在变异链球菌定殖到牙面的过程中发挥主要作用。对于龋齿的治疗通常是使用抗生素药物，但长期使用抗生素不仅会使口腔中微生物系统失衡，还会使细菌耐药性增强，不利于口腔健康。乳酸菌是一种有益于人体健康的重要微生物，同时也存在于人口腔中，对于维持口腔微生态平衡具有重要作用。从乳酸菌中筛选有益于口腔健康的益生菌受到了研究者们越来越多的关注。

随着益生菌疗法在防治胃肠道感染疾病方面的优势日益明显，这种治疗方式也逐渐应用到口腔领域。近年来，很多的研究表明，益生菌在保持口腔健康、预防口腔疾病等方面都起到了重要作用。益生菌能够在一定程度上抑制致龋菌的活性，尤其可减少变异链球菌的数量，大大减小了龋病的发生率。此外，口腔中的乳杆菌还能够抑制牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）等导致牙周炎的致病菌和中间普雷沃菌（Prevotella intermedia）的生长。所以，利用益生菌的抑菌特性来抑制口腔中有害菌，减少龋齿等口腔疾病的发生，同时不破坏口腔微生物平衡，是一种很好的预防和治疗方法。

本研究从实验室保藏的乳酸菌菌株中筛选出对口腔变异链球菌具有抑制作用的优良菌株，并研究了乳酸菌对变异链球菌菌膜形成和黏附性的抑制作用，为进一步利用乳酸菌的益生特性来预防与改善龋齿等口腔疾病提供理论基础。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

1.1.1　菌种

乳酸菌共96株，其中植物乳杆菌K25，口腔致病菌变异链球菌1.3771、1.2500、1.2499，变异链球菌10438。

1.1.2　试剂与培养基

甲醇、冰醋酸、结晶紫、乳酸、乙酸 北京化工厂；胰蛋白酶、胃蛋白酶、过氧化氢酶 。

MRS液体培养基：葡萄糖20 g、蛋白胨10.00 g、牛肉膏10.00 g、酵母浸粉5.00 g、无水乙酸钠5.00 g、柠檬酸钠5.00 g、磷酸氢二钠2.00 g、吐温-80 1 mL、七水硫酸镁0.50 g、硫酸锰0.05 g，加水至1 000 mL，1 mol/L乙酸调至pH 6.6。121 ℃、102 kPa条件下灭菌15 min。

BHI液体培养基：心提取物5.0 g、脑提取物12.5 g、蛋白胨10.0 g、葡萄糖2.0 g、NaCl 5.0 g、Na 2HPO 42.5 g、琼脂15.0 g，蒸馏水定容至1.0 L，pH 7.4。121 ℃、102 kPa条件下灭菌15 min。

1.2　仪器与设备

MLS-3750高压蒸汽灭菌器 日本三洋公司；CR21GⅢ立式高速冷冻离心机、U-3900紫外-可见分光光度计 日本日立公司；数显pH 计 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；ELx800酶标仪 美国Bio-Rad仪器有限公司。

1.3　方法

1.3.1　抑制变异链球菌生长的乳酸菌筛选

采用牛津杯法筛选出可以抑制变异链球菌的乳酸菌，具体操作参考Bosch等的实验方法。将1.5 g/100 mL的BHI琼脂培养基倒入平板中，待凝固后分别取20 μL变异链球菌10438、1.2499、1.3771、1.2500菌液涂布于平板上，然后将牛津杯固定在平板上，取100 μL提前活化好的乳酸菌的上清液加入到牛津杯中，将平板放在37 ℃恒温培养箱中，培养24 h。测量抑菌圈的直径，最终抑菌圈的大小可以反映菌株对变异链球菌生长抑制作用的强弱。抑菌效果按以下标准评定：无抑菌圈，代表无抑制作用（-）；抑菌圈直径0～3 mm，代表抑菌效果弱（+）；抑菌圈直径3～6 mm，代表抑菌效果良好（++）；抑菌圈直径＞6 mm，代表抑菌效果强（+++）。

1.3.2　植物乳杆菌对变异链球菌生长过程的影响

将筛选到的植物乳杆菌菌株按体积分数3%接种于MRS液体培养基中，37 ℃培养16 h后10 000r/min离心 15 min得上清液，分别测定不同植物乳杆菌培养上清液对变异链球菌生长的影响。每株变异链球菌按体积分数3%的接种量接种于5 mL BHI液体培养基中，分别添加5 mL植物乳杆菌培养上清液，37 ℃培养48 h，每4 h取出一定量培养液，在600 nm波长处测定其光密度（OD）值。每组设置3 个平行，绘制变异链球菌的生长曲线。以不添加植物乳杆菌上清液的变异链球菌的生长曲线为对照。

1.3.3　植物乳杆菌对变异链球菌的最小抑菌浓度的测定

用紫外分光光度计将筛选出的抑菌效果较好的植物乳杆菌菌株的上清液，调整到1.00×10 8CFU/mL，分别稀释至菌液浓度5.00×10 7、2.50×10 7、1.25×10 7、6.25×10 6、3.12×10 6CFU /mL，分别对变异链球菌做抑菌实验，方法见1.3.1节牛津杯法。最小抑菌浓度以有抑菌圈的最小浓度为准。

1.3.4　植物乳杆菌对变异链球菌菌膜形成的抑制作用

利用BHI液体培养基将活化好的变异链球菌的菌液浓度调整到1.0×10 8CFU/mL，将植物乳杆菌K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1活化后， 5 000 r/min离心5 min，用滤膜（0.22 μm）过滤，得到上清液，取100 μL菌液与100 μL上清液混合均匀，加入到96 孔微量板中，以只添加MRS液体培养基的孔为阴性对照。37 ℃培养24 h后，弃掉孔中培养液，加入200 μL PBS，将每孔清洗3 次，清洗时需不断强烈振动以除去未黏附的细菌。弃掉PBS，每孔加入200 μL 95%甲醇，固定15 min，弃掉甲醇后，置于室温下自然干燥。再在每孔加入200 μL 2%的结晶紫，革兰氏染色5 min，用去离子水冲洗，去掉多余的染料，室温条件下自然干燥。每孔再加入160 μL 体积分数33%的冰醋酸，重新将黏附在细菌上的染料溶解下来。从每孔取125 μL可溶性染料转移到新的96 孔板中，在630 nm波长处测定OD值。菌膜抑制率计算见公式（1）。

1.3.5　植物乳杆菌对变异链球菌黏附性的影响

参照文献中的方法进行细菌的黏附性实验。将试管与水平面呈30° 角放置并固定，每组设3 个平行管，每个试管分别加3 mL植物乳杆菌上清液和3 mL变异链球菌菌悬液，37 ℃厌氧培养24 h。取出试管，分别收集试管中紧密黏附、松散黏附和非黏附于试管壁的细菌，收集方法参考周智等的方法。以只添加MRS培养基的孔为对照。将收集好的菌悬液分别加入96 孔微量板中，每孔加200 μL，用PBS调零，用酶标仪测定每孔630 nm波长处的吸光度。按公式（2）计算细菌黏附率，其中紧密黏附菌悬液的吸光度记为A 紧，非黏附和松散黏附菌悬液的吸光度记为A 非+松。

1.3.6　植物乳杆菌对变异链球菌抑菌机理的分析

1.3.6.1　乳酸对变异链球菌的影响

用乳酸溶液调MRS液体培养基直至与植物乳杆菌K25培养上清液相同的pH值（pH 4.04），釆用牛津杯法分别做植物乳杆菌K25培养上清液和乳酸培养液对变异链球菌1.2499、1.2500的抑菌实验，静置24 h后测量抑菌圈直径。实验组为用乳酸调节的上清液，对照组为植物乳杆菌K25培养物上清液。

1.3.6.2　过氧化氢酶对变异链球菌的影响

在植物乳杆菌K25培养上清液中分别加入适量过氧化氢酶，使过氧化氢酶的最终质量浓度为0.5 mg/mL，于28 ℃恒温水浴2 h 后取出，静置24 h后用牛津杯法测定过氧化氢酶对变异链球菌1.2499、1.2500抑菌圈的大小，对照组为不加过氧化氢酶的植物乳杆菌K25培养上清液。

1.3.6.3　蛋白酶对变异链球菌的影响

在植物乳杆菌K25的培养上清液中加入一定量胃蛋白酶和胰蛋白酶，使蛋白酶最终质量浓度为1 mg/mL，于28 ℃恒温水浴2 h后取出，静置24 h后牛津杯法测定对变异链球菌1.2499、1.2500的抑菌圈大小，对照组为未经蛋白酶处理的植物乳杆菌K25培养上清液。

1.4　数据统计分析

采用SPSS 16.0软件进行数据统计处理，Turkey检验方法用于比较各实验组与对照组之间差异的显著性。P＞0.05表示差异不著性，P＜0.05表示差异显著。

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