乳酸乳球菌乳亚种细菌素的分离纯化（一）

乳酸链球菌素是联合国粮农组织/世界卫生组织食品法典委员会在1969年唯一认定为安全的菌素，可作为食品添加剂。但乳酸链球菌素只能在一定的pH值范围内（pH 3.5～8.0）发挥作用，并且随着pH值和温度的升高，其活性也会下降。因此，相对于乳酸链球菌素，市场上更需要活力强且使用范围广的新型细菌素有效遏制致病菌的滋生，以推动食品防腐剂市场的发展。目前自然发酵泡菜已经成为分离产细菌素乳酸菌的重要渠道。例如，高兆建等从泡菜中筛选到1 株产细菌素的发酵乳杆菌，其产细菌素BLF52分子质量为5.6 kDa，并且在一定的温度和pH值范围内具有良好的稳定性，对金黄色葡萄球菌具有显著抑制作用。

此外，Gao Yurong等也从传统发酵卷心菜中筛选到1 株格氏乳杆菌，其所产细菌素对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有抑制作用。但目前对分离自传统发酵泡菜中的乳酸乳球菌乳亚种所产细菌素的研究相对较少。本研究旨在对筛选自传统发酵泡菜中的乳酸乳球菌乳亚种所产细菌素进行分离鉴定，并探究其对金黄色葡萄球菌的抑菌机制，为食品级细菌素在食品行业和制药领域中的应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

指示菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003保藏于南昌大学国家食品科学与技术重点实验室。

MRS（de Man, Rogosa and Sharpe）培养基 广东环凯生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、α-糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、过氧化氢酶、脂肪酶、淀粉酶、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（2×）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色试剂盒、低分子质量蛋白Marker 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪美国Applied Biosysterms公司；酶标仪 赛默飞世尔科技有限公司；DM300B正置荧光显微镜 德国徕卡公司；凝胶电泳系统、凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；SP Sepharose Fast Flow手动纯化预装柱 武汉晶诚生物科技公司；Optima 8000 ICP-AES电感耦合等离子体发射光谱仪 美国珀金埃尔默仪器有限公司；冷场发射扫描电镜 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 产细菌素乳酸菌的筛选

1.3.1.1 样品采集及乳酸菌分离

从市场上采集不同种类自然发酵的泡菜样本22 份。从泡菜样品中取1 mL泡菜液用无菌生理盐水进行梯度稀释，选取10－3、10－4、10－5三个梯度各100 μL分别涂布于MRS固体培养基（含溴甲酚紫）上，37 ℃倒置培养48 h。挑取培养基上不同形态的菌落进行连续划线分离。随后在培养基上挑取产黄色光晕且形态单一的菌落于10 mL MRS液体培养基中孵育24 h，将培养液和50%的无菌甘油按1∶1体积比混合并保存于－80 ℃。

1.3.1.2 产抑菌物质乳酸菌的筛选

将活化好的198 株乳酸菌疑似株以2%（V/V）的接种量接种到MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h得到乳酸菌发酵液。将发酵液6 500×g离心10 min后收集上清液，为了排除发酵液pH值对抑菌结果的影响，调节其pH 6.1±0.1并用0.22 μm微孔滤膜过滤，保存至4 ℃待用。

使用琼脂扩散法测定不同菌株发酵上清液的抑菌活性。简言之，将培养好的金黄色葡萄球菌加入LB（Luria-Bertani）固体培养基中使其浓度为1.0×107 CFU/mL，混匀后倒平板，待冷却凝固后打孔（6 mm），每皿3 个孔，向每孔中加入200 μL制备好的上述分离菌株的发酵上清液，37 ℃下培养14～16 h，根据抑菌圈直径大小筛选抑菌性能优异的菌株。

1.3.1.3 产细菌素乳酸菌的16S rDNA鉴定

使用细菌DNA提取试剂盒对抑菌性能优异的乳酸菌菌株进行基因组DNA的提取。以细菌通用引物27 F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492 R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行PCR扩增。将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将所得序列在NCBI数据库中使用BLAST工具进行同源性比较，将测序结果导入MEGA5.2中，采用Neighbor-Joining构建系统发育树。

1.3.2 抑菌物质性质的初步探索

参照1.3.1.2节方法制备复筛出的抑菌优异菌株的发酵上清液，将上清液分别在不同温度（60、70、80、90、100 ℃水浴和121 ℃高压蒸汽）处理30 min；不同pH值（2、3、4、5、6、7、8、9、10）处理2 h，之后调回pH 6.1；不同酶（过氧化氢酶、淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、α-糜蛋白酶）处理2 h，随后于100 ℃灭活5 min，酶的最终质量浓度为1 mg/mL。以未处理的发酵上清液作为对照。采用琼脂扩散法测定不同处理组的抑菌活性，探究不同处理条件对乳酸乳球菌乳亚种NCU036018无菌发酵上清液抑菌活性的影响。

1.3.3 乳酸乳球菌乳亚种NCU036018生长及抑菌活性曲线

活化后的乳酸乳球菌乳亚种NCU036018按照2%（V/V）比例接种于新鲜的MRS液体培养基中，在37 ℃条件下静置培养36 h，每2 h取样一次，分别测试发酵液的OD600 nm、pH值、无细胞发酵上清液的抑菌活性（琼脂孔扩散法）。观察乳酸乳球菌乳亚种NCU036018在发酵过程中生长曲线、pH值和产细菌素的关系，确定细菌素的最适发酵时间。

1.3.4 细菌素的分离纯化

1.3.4.1 硫酸铵沉淀

向制备好的乳酸乳球菌乳亚种NCU036018发酵上清液中缓慢添加硫酸铵，使溶液中硫酸铵饱和度分别为20%、40%、50%、60%、70%、80%，低温磁力搅拌过夜，4 ℃、8 000×g离心15 min，弃去上清液，收集沉淀，并复溶于甲酸铵缓冲盐溶液（0.01 mol/L、pH 3.5）中，琼脂扩散法测定抑菌活性，确定最适的硫酸铵饱和度。

1.3.4.2 超滤

将复溶后的细菌素粗提物转移至超滤管中，分别先后通过截留分子质量为30、10、3 kDa的超滤管进行超滤截留（4 ℃、3 500×g、25 min），收集不同的组分，采用琼脂扩散法检测不同组分的抑菌活性。

1.3.4.3 SP Sepharose Fast Flow纯化

选择具有抑菌活性的超滤组分采用Sepharose Fast Flow琼脂糖凝胶柱（1.5 cm×10 cm）进行层析。20 mmol/L、pH 6.0的磷酸缓冲液充分平衡后，采用不同浓度的NaCl（0～1 mol/L）进行线性梯度洗脱，流速1 mL/min。将洗脱液进行真空冷冻干燥并复溶于ddH2O中，采用点种法确定具有抑菌活性的洗脱组分，以获得较高纯度的细菌素。

1.3.4.4 Tricine-SDS-PAGE分子质量测定及凝胶原位抑菌检测

将Marker和预处理过的细菌素样品依次加入上样孔中进行SDS-PAGE，两块凝胶同时进行。电泳完成后将其中一块凝胶转移至考马斯亮蓝G-250染液中染色6 h，随后转移至脱色液中脱色6 h。观察样品条带位置并确定其分子质量。另外一块凝胶浸泡于洗涤液（异丙醇∶乙酸∶水=5∶2∶13），洗涤6～8 h，再用无菌水洗6 h，最后转移至无菌培养皿中，覆盖上一层含有金黄色葡萄球菌的LB固体培养基，37 ℃培养14～16 h，观察条带位置是否具有抑菌活性。

1.3.5 乳球菌素036018的抑菌机制

1.3.5.1 乳球菌素036018对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度

将制得的乳球菌素036018溶液用PBS以两倍稀释法逐步稀释2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024、2 048 倍。以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用琼脂扩散法测定抑菌活性。以肉眼观察到产生抑菌圈最小的浓度为乳球菌素036018对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.3.5.2 乳球菌素036018对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制

参照Pei Jinjin等的方法进行金黄色葡萄球菌生物膜形成的测定。6 500×g、4 ℃离心10 min收集稳定期金黄色葡萄球菌，用LB培养基重悬至OD600 nm为0.1，吸取100 μL重悬液至96 孔板中，加入等体积的乳球菌素036018溶液于37 ℃孵育24 h，以PBS处理的菌悬液为阴性对照。小心除去未附着的细胞，PBS洗涤3 次后甲醇固定10 min，风干后再加入200 μL 0.1%的结晶紫室温染色30 min。用PBS洗涤3 次除去多余的结晶紫。

1.3.5.3 K＋泄漏

K＋浓度的测定按照段改丽的方法并进行一定修改。6 500×g、4 ℃离心10 min收集稳定期金黄色葡萄球菌。PBS洗涤2 次后重悬至OD600 nm为0.5，加入等体积乳球菌素036018溶液于37 ℃孵育0、0.5、1、2、3 h，PBS进行相同处理的金黄色葡萄球菌作为对照组，使用电感耦合等离子体发射光谱仪检测上清液中K＋浓度。

1.3.5.4 PI染色

采用Lu Yingying等的方法进行PI染色。6 500×g、4 ℃离心10 min收集稳定期金黄色葡萄球菌，用PBS重悬菌体后，按照1∶1比例加入乳球菌素036018溶液分别处理0.5、1、2 h。之后用PBS缓冲液洗涤菌体2 次，重悬细胞并调整浓度为106 CFU/mL，取95 μL细胞重悬液加入5 μL PI染色液，混匀后室温避光孵育5～30 min，在荧光显微镜下观察菌体染色情况。

1.3.5.5 扫描电子显微镜观察

根据Lv Xin等的方法利用扫描电镜观察细胞形态。离心收集稳定期金黄色葡萄球菌菌体，PBS洗涤两次，重悬于等体积乳球菌素036018溶液中分别处理30 min、1 h、2 h。6 500×g、4 ℃离心10 min收集菌体，用PBS洗涤2 次。加入2.5%戊二醛4 ℃固定过夜。6 500×g、4 ℃离心5 min收集菌体，无菌水洗涤3 次。依次使用系列体积分数梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%、100%）脱水。随后将悬浮在100%乙醇中的菌体转移到干净的硅片上，室温晾干后喷金，以PBS进行相同处理作为对照，通过冷场发射扫描电镜观察菌体的表面结构。

1.3.6 乳球菌素036018在牛奶中的应用

6 500×g、4 ℃离心5 min收集稳定期金黄色葡萄球菌，用生理盐水重悬并调节其浓度为2×108 CFU/mL，取1 mL菌悬液加入9 mL的巴氏灭菌牛奶中。再分别加入乳球菌素036018溶液使其浓度分别为2、4、8 倍MIC。充分混匀后放于4 ℃贮藏12 h，每隔2 h取样计活菌数。分别加入等体积PBS作为阴性对照。

1.4 数据处理与统计分析

所有实验结果均为测定3 次，采用IBM SPSS 22.0软件进行数据分析，采用单因素方差分析结合Duncan法检验差异显著性。

相关链接：格氏乳杆菌，乳酸乳球菌乳亚种，胰蛋白酶，蛋白酶K，乳酸菌，金黄色葡萄球菌，北纳生物

本文章来源于——《食品科学网》，如有版权问题，请与本网联系